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本制品是基于荧光染料检测的即用型RT-PCR试剂盒，可以对靶RNA分子进行实时定量RT-PCR分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、逆转录酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA稳定剂、dNTPs、MgCl₂和稳定剂等所有染料法qRT-PCR所需要的成分，用户只需加入RNA模板和引物即可进行染料法实时定量RT-PCR反应，具有广泛的用途。

• 即开即用，用户只需准备模板、引物和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行染料法实时定量RT-PCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
  
• 各成分的浓度和比例都经过精心优化，用户不需要再优化反应。
  
• 反应的灵敏度高，最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
  
• 灵敏度和专一性比常规RT-PCR更高。
  
• 可用于基因表达分析、SNP分析、拷贝数分析等实验。
  
• 既可用于定性，也可用于定量。

• 配制反应体系：
  如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照(NC)。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照(PC)，用户自己需要根据下表进行适当修改(把6个标曲反应改成1个阳性对照反应)。
  

  成分	N个样品管	6个标准曲线管	NC管
  2×染料法qRT-PCR缓冲液	各10μL	各10μL	10μL
  自备引物1(10μM)	各1μL	各1μL	1μL
  自备引物2(10μM)	各1μL	各1μL	1μL
  N个自备模板RNA	各1～2μL	不加	不加
  自备阳性对照模板(6个梯度)	不加	各1μL(1管加1个梯度)	不加
  阴性对照模板（水）	不加	不加	1μL
  50×ROX	各0.4μL	各0.4μL	0.4μL
  10×染料法qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL
  超纯水	至20μL	至20μL	至20μL

  • 关于ROX：下列信息仅供参考，具体以qPCR仪器的使用手册为准。
    ① 不需要ROX的机型：Agilent MX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480，Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
    ② 需要使用ROX I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
    ③ 需要使用ROX II的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。
• 反应程序：
  放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物的Tm值等进行调节。
  
  • 一般选择三步法PCR：
    

    步骤	反应参数	备注
    逆转录(RT步骤)	50℃ 30分钟
    预变性	94℃ 2分钟
    PCR循环 (35～45次)	94℃ 15秒
    	55～65℃ 15～30秒	在此步采集FAM通道的荧光信号
    	72℃ 30秒

  • 如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
    

    步骤	反应参数	备注
    逆转录(RT步骤)	50℃ 30分钟
    预变性	94℃ 2分钟
    PCR循环 (35～45次)	94℃ 15秒
    	60℃ 30～60秒	在此步采集FAM通道的荧光信号

• 数据处理：
  如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
  如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照Ct大于或等于40（阈值需要以阴性对照的Ct值确定，此处为便于叙述以40为例，具体情况很可能阈值不一样）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。